A.V.L.T.

Con la presente, il Centro di Biotecnologie dell’Università di Ferrara (CBF), Via Fossato di Mortara n. 64B (tel. 0532-291550; fax 0532-291549) e l’Associazione Veneta per la lotta alla Talassemia, nazionalità italiana, c/o Centro di Microcitemia dell’Azienda ULSS 18, Rovigo, (IT)

Il Laboratorio è diretto da un Responsabile, coadiuvato da un Consiglio formato dallo stesso responsabile, dai ricercatori coinvolti e dai rappresentanti dell’Associazione. Il Consiglio programma e valuta l’attività riunendosi almeno due volte all’anno. Il Responsabile presenta all’Associazione il programma annuale di attività, inviando ogni anno una relazione scritta sull’attività svolta.

Sede prevista del Laboratorio è presso il Centro di Biotecnologie dell’Università di Ferrara (CBF).


L’attività pregressa del Centro di Biotecnologie dell’Università di Ferrara (CBF) si può riassumere nelle seguenti attività. (a) Attività finalizzate a ricerche biotecnologiche di rilievo in ambito biomedico e nel settore farmaceutico. Questa attività si è concretizzata, nell’ultimo anno, alla produzione di 115 pubblicazioni su riviste ISI, per un totale di IF pari a 148.445 (1997), 116.824 (1998) e 236.431 (1999) per un IFmedio di 4.24 (1997), 3.24 (1998) e 5.37 (1999). (b) Attività di sostegno a gruppi di ricerca dell’Ateneo. Questa attività ha comportato essenzialmente l’utilizzo “facilitato” delle grandi attrezzature del CBF (indicate successivamente) da parte di numerosi gruppi di ricerca. Inoltre, l’attività di sostegno della ricerca di Ateneo si è concretizzata nell’utilizzo di una serie di piccole attrezzature che il CBF ha considerato in multiutenza. Il CBF è stato frequentato da almeno 45 utenti nel 1998 e da almeno 83 utenti nel 1999 in 746 e 1357 momenti di utilizzo di strumentazioni, rispettivamente (dato ricavabile da un monitoraggio quotidiano autogestito). (c) Servizio di sequenziamento. In data 1 dicembre 1998 ha preso servizio presso il CBF l’unico tecnico-laureato attualmente operante presso il Centro, la Dott.ssa Giordana Feriotto. Ciò ha permesso di attivare il servizio di sequenziamento del DNA. Nel corso del 1999 il CBF ha effettuato 757 reazioni di sequenza, utilizzando l'ABI PRISM 377 DNA SEQUENCER e fornendo un servizio ad un prezzo contenuto . Attualmente, il CBF è un Centro di Ateneo. La composizione del Consiglio Direttivo è la seguente: Prof. Giuseppe Barbanti-Brodano, Dott. Giovanni Bernacchia; Prof. Alfredo Corallini; Prof. Roberto Gambari (Direttore); Dott. Carlo Mair; Prof. Roberto Manservigi; Prof. Adriano Piffanelli; Prof. Roberto Tomatis; Dott. Stefano Volinia, Prof. Fabrizio Zucchi. La composizione del Comitato Scientifico è la seguente:  Prof. Pier Giovanni Baraldi; Prof. Giuseppe Barbanti-Brodano; Prof. Olavio Baricordi; Prof. Francesco Bernardi; Prof. Silvano Capitani; Dott. Antonella Caputo; Prof. Francesco Conconi; Prof. Laura del Senno; Prof. Francesco Di Virgilio; Prof. Giovanna Marchetti; Dott. Roberta Piva; Prof. Angelo Scatturin; Dott. Michele Simonato; Prof. Mauro Tognon; Dott. Francesco Zorzato. Tra le apparecchiature di particolare rilevanza presenti presso il Centro citiamo un Sequenziatore di DNA ALF DNA Sequencing System (Pharmacia) (L.152 milioni), un Sequenziatore di DNA ABI PRISM 377 DNA SEQUENCER (Perkin-Elmer) (L. 240 milioni), un Citofluorimetro a flusso FacStar plus accessoriato (FACS = Flow Activated Cell Sorter) (Becton-Dickinson) (L. 293 milioni), N.2 Laboratori a contenimento biologico di classe P3 (L.550 milioni), un BIAcore-1000 System (Pharmacia Biosensors) (L. 240 milioni), HPLC preparative (Millipore): (35 milioni), un Sintetizzatore di peptidi automatico Milligen (Millipore) (L. 107 milioni), un Sistema integrato di estrazione e quantificazione del DNA (Kontron instruments) (L. 67 milioni) un Contatore Beta mod. 2100 TR (Camberra Packard) (L. 31 milioni).
Tra gli obiettivi specifici a breve scadenza delle attività del CBF sono per il triennio 2000-2002 possono essere citati i seguenti: (a) sviluppare micro-chips in grado di potere eseguire gene profiling e gene expression profiling in diagnostica genetica, in diagnostica oncologica, in biologia molecolare e virologia, in studi di genetica di popolazioni, in studi di ecologia sistematica ed applicata, in studi sul controllo degli alimenti, in studi sulla produzione di farmaci; (b) sviluppare sistemi integrati per la bioseparazione analitica e preparativa di materiale di origine vegetale, di microorganismi (anche ingegnerizzati), di tessuti; (c) sviluppare metodiche mirate alla radiomarcatura di molecole bioattive. Gli obiettivi a lungo termine si possono riassumere nel rendere continuative forme di collaborazioni/servizi con piccole e medie imprese del settore biotecnologico, con Istituti di Ricerca nazionali e con servizi ospedalieri allo scopo di finalizzare le ricerche oggetto della sperimentazione proposta.

Gli obiettivi del Laboratorio di Ricerca per lo Sviluppo della Terapia Farmacologica e Genica della Talassemia sono i seguenti:



1.      Coordinare le ricerche  volte alla identificazione di nuovi induttori del differenziamento eritroide in cellule K562.


2.      Acquisire nuove tecniche di isolamento, clonazione e differenziamento in vitro di cellule ematopoietiche. Un primo obiettivo sarà quello di trasferire presso l’Università degli Studi di Ferrara il metodo sviluppato da Eitan Fibach (Blood, 73, 100-103, 1989) sulle colture eritroidi da sangue periferico. Questo metodo è fondamentale per la valorizzazione delle ricerche effettuate sulle cellule K562 e permetterebbe di valorizzare anche  scoperte oggetto di brevetto riguardanti potenziali induttori dell’espressione dei geni g-globinici.

3.      Produrre brevetti su molecole in grado di indurre il differenziamento eritroide. Si prevede di essere in grado di produrre 3 brevetti nel triennio 2000-2002.

4.      Eseguire le ricerche esplicitate nel Programma di Ricerca sottomesso a Telethon-2000 (allegato n.1). Questo Programma di Ricerca prevede un approfondimento molecolare delle ricerche recentemente brevettate su oligonucleotidi sintetici in grado di indurre il differenziamento eritroide e fa parte integrante del presente accordo di collaborazione.

5.      Coordinare ricerche che riguardano l’utilizzo di microchip-arrays nella diagnostica molecolare della talassemia (“Gene profiling”). Queste ricerche rappresentano una novità nel campo della diagnostica molecolare e della ricerca farmacologica. Uno degli obiettivi del CBF e del Consorzio Interuniversitario di Biotecnologie (C.I.B.), del quale l’Ateneo di Ferrara fa parte, è proprio quello di sostenere ricerche riguardanti il cosiddetto “gene expression profiling”. Il Laboratorio si potrebbe inserire in questo Progetto effettuando ricerche utili per valutare l’effetto sull’espressione genica di molecole in grado di indurre HbF.

6.      Pubblicare su riviste di elevato prestigio internazionale le ricerche sulla Talassemia. Il nome dell’Associazione dovrà essere riportato sulle eventuali pubblicazioni scientifiche.

7.      Organizzare seminari di informazione sull’attività di ricerca internazionale riguardante le emoglobinopatie e temi affini.

8.      Coordinare anche interventi di tipo divulgativo sulle basi molecolari e sulla terapia della b-talassemia finalizzati a diffondere le ricerche presso studenti universitari e scuole secondarie.

9.      Mettere a punto RT-PCR quantitativa per l’identificazione dei trascritti g-globinici.



In conclusione, lo scopo del presente accordo di collaborazione è la identificazione e la caratterizzazione di fattori di trascrizione che regolano l’espressione del gene umano per la globina g con particolare riferimento a fattori proteici che agiscono come “silencers” del processo di trascrizione. L’obiettivo applicativo è quello di disegnare oligonucleotidi sintetici (ODN) e acidi peptido-nucleici (PNA) in grado di alterare la trascrizione dei geni per le globine attraverso decoy, strategie antisenso e strategie antigéne. Infine, il Laboratorio si propone di identificare nuovi induttori del differenziamento eritroide in grado di promuovere la trascrizione dei geni globinici, con particolare riferimento ai geni codificanti per la globina g e la globina e.



Una prima fase della ricerca che sarà sviluppata nell’ambito del Laboratorio prevede la caratterizzazione del promotore dei geni g-globinici, attraverso la sistematica analisi delle interazioni tra fattori nucleari e sequenze oligonucleotidiche.
Una seconda fase prevede il disegno e la sintesi di ODN e PNA potenzialmente in grado di alterare in vitro ed ex vivo la trascrizione dei geni g-globinici.
Una terza fase prevede l'analisi di composti leganti il solco minore del DNA con selettività di sequenza, allo scopo di identificare quelli in grado di indurre il differenziamento eritroide.
Una quarta fase prevede la determinazione del tipo di emoglobine sintetizzate nei sistemi cellulari prescelti e lo studio molecolare della trascrizione dei geni per le globine, allo scopo di identificare modificatori del processo di trascrizione in grado di agire preferenzialmente sui geni g-globinici.
Una quinta fase della ricerca che sarà sviluppata nell’ambito del Laboratorio prevede una valutazione del differenziamento eritroide nel caso in cui gli ODN e i PNA sintetizzati vengano somministrati alle cellule insieme ad altri riconosciuti induttori del differenziamento eritroide, come ad esempio butirrati, ara-C, acido retinoico, 5-azacitidina.
Una sesta fase prevede uno studio del “delivery” dei modificatori del processo di trascrizione utilizzando liposomi, microsfere, Biolistic.

3.1. Proliferazione cellulare. Le cellule leucemiche umane K562 e le cellule eritroleucemiche murine FLC saranno coltivate in a-medium o in RPMI. In queste condizioni il plateau di densità cellulare è raggiunto in 5-8 giorni per le K562 (ciclo cellulare = 24 ore), in 3 giorni dalle FLC (ciclo cellulare = 9 ore). Le fasi del ciclo cellulare saranno analizzate eseguendo analisi di citofluorometria a flusso. Il numero di cellule/ml di coltura sarà monitorato giornalmente.


3.2. Differenziamento eritroide. Sarà in primo luogo analizzato con tecniche istochimiche, utilizzando la colorazione con benzidina. Il queste condizioni le cellule che differenziano in senso eritroide assumono una intensa colorazione blu.


3.3. Analisi delle emoglobine prodotte. L'analisi delle emoglobine prodotte sarà effettuata attraverso elettroforesi di gel di acetato di cellulosa e colorazione del gel con benzidina.


3.4. Isolamento del DNA e Southern blotting. La digestione del DNA con enzimi di restrizione e l'analisi del DNA su gel di agarosio saranno effettuate con procedure standard.

3.5. Northern blotting e RT-PCR quantitativa. L'estrazione dell'RNA cellulare da cellule K562 e FLC in sospensione sarà effettuato utilizzando RNA-B Bioprobe ZOL. Va chiarito a questo proposito che le sonde molecolari che saranno utilizzate sono le seguenti: (a) sonde per il recettore della transferrina; (b) sonda per i geni globinici e, g, b; (c) sonda per l'actina; (d) sonda in grado di ibridizzare con l'RNA ribosomale. La RT-PCR quantitativa sarà messa a punto utilizzando l’ABI Prism 7700 (PE Biosystems).


3.6. Trascrizione in vitro. La valutazione del processo di trascrizione in vitro sarà effettuata utilizzando il promotore dei geni g-globinici clonato (a) a monte del gene CAT o (b) a monte del gene per la luciferasi.


3.7. Interazioni biomolecolari. L’interazione tra (a) fattori di trascrizione e promotore g-globinico e (b) composti leganti il DNA e promotore sarà effettuata sia utilizzando tecniche biomolecolari (gel shift, Dnase I footprinting), sia utilizzando la tecnologia SPR e il biosensore BIAcore-1000 (Pharmacia).


3.8. Modificazione della trascrizione. Le tecniche utilizzate per modificare la trascrizione dei geni globinici in vitro ed ex vivo prevedono (a) l’utilizzo di oligonucleotidi formanti tripla elica (TFO), (b) l’utilizzo di ODN o PNA “decoy” e (c) l’utilizzo di AS-ODN contro mRNA per silencers del processo di trascrizione dei geni g-globinici. L’interferenza con l’interazione tra silencers e promotore g-globinico (con TFO o ODN e PNA decoy) e la strategia antisenso potrebbero essere in grado di potenziare la trascrzione e/o riattivarla in cellule eritroidi.


3.9. Proliferazione e maturazione di progenitori eritroidi umani in coltura liquida. Saranno effettuate trasferendo presso l’Ateneo di Ferrara il metodo Fibach (Blood, 73, 100-103, 1989) sulle colture eritroidi da sangue periferico. Questo metodo è fondamentale per la valorizzazione delle ricerche effettuate sulle cellule K562 e permetterebbe di valorizzare anche  scoperte oggetto di brevetto riguardanti potenziali induttori dell’espressione dei geni g-globinici.

Per l’attuazione delle ricerche del Laboratorio il CBF mette a disposizione strumentazione adeguata. Inoltre, ulteriori strumentazioni (gestite dal Prof. Roberto Gambari) sono dislocate presso il Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare. Gli esperimenti effettuati presso il Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare saranno in parte seguiti dalla Dott.ssa Nicoletta Bianchi, tecnico presso il dipartimento stesso.


Strumenti messi a disposizione (valutazione – ML)


CBF

-Densitometro BIO-RAD (15 ML)

-Phorphorimager BIO-RAD completo

di Computer Macintosh-QUADRA (25 ML)

-Cappa a flusso laminare NUAIRE (10 ML)

-Cappa a flusso laminare Haereus (12 ML)

-Sistema UVP completo di Computer IBM (10 ML)

-Biolistic Delivery System (BIO-RAD) (20 ML)

-Reattore per PCR MJ (8 ML)

-Micromanipolatore LEITZ (10 ML)

-Microscpio LEICA (20 ML)

-Centrifuga Beckman da tavolo refrigerata (5 ML)

-Incubatore Haereus (8 ML)

-Incubatore rotante per ibridazione Oncor (3 ML)

-Speed-Vac (12 ML)

-DNA Sequencer System Pharmacia (80 ML)

-BIAcore-1000 (250 ML)



Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare

-Reattore per PCR Perkin-Elmer (9 ML)

-Cappa a flusso laminare Haereus (10 ML)

-Reattore per PCR MJ (7 ML)

-Ultracentrifuga Beckman TL-100 (50 ML)

-Centrifuga Beckman da tavolo (4 ML)

-Incubatore rotante per ibridazione Biometra (3 ML)

-Stazione Robotizzata BIOMEK-1000 (Beckman) (20 ML)

-n.6 Power Supplyes (8 ML)

-n.15 apparati per elettroforesi orizzontale (4 ML)

-Microscopio a fluorescenza Olimpus (16 ML)

-n.3 apparati per elettroforesi verticale (3 ML)

-n.2 apparati per gel di sequenza (2 ML)

-Gel Drier BIO-RAD (2 ML)

-ABI Prism 7700 PE Biosystem (160 ML)

La decorrenza dell’attività del Laboratorio sarà a partire da luglio 2000. La durata dell’accordo è prevista in quattro anni. I finanziamenti saranno erogati annualmente in via anticipata salvo accordi specifici. L’Associazione partecipa all’attività del Laboratorio attraverso i seguenti interventi.


Utilizzo di spazi e strumentazioni del CBF. E’ prevista una quota di affitto locali pari a 2.500.000/semestre.


Budget per la ricerca. E’ previsto per un ammontare di 50.000.000/anno. Tale contributo sarà inferiore se al Prof. Roberto Gambari saranno assegnati finanziamenti Telethon (o di altri Enti non universitari) per ricerche sulla Talassemia.


Personale. L’Associazione interverrà coprendo le spese per


(a)    un contratto annuale, rinnovabile (compiti scientifici : identificare induttori del differenziamento eritroide su cellule K562)

(b)   una borsa di studio riservata a un dottorando in Biotecnologie iscritto al dottorato stesso a costo zero.


Strumentazioni. L’Associazione provvederà all’acquisto del seguente materiale inventariabile:

Un microscopio con apparecchiatura fotografica            12.000.000
Un contacellule                                                                  12.000.000
Incubatore CO2                                                                  6.000.000


Questo materiale rimarrà di proprietà dell’Associazione che lo darà in comodato d’uso al Laboratorio. L’Associazione potrà trasferire altrove i suddetti strumenti, ove lo ritenesse opportuno. I costi di manutenzione sono a carico del Laboratorio e saranno coperti utilizzando il budget dedicato alla ricerca (vedi punto sopra descritto).

Nuove Tecnologie. L’Associazione sarà consultata nel caso si presentasse l’opportunità di partecipare all’acquisizione di strumentazioni innovative di grande interesse per la ricerca sulla talassemia (ad esempio sistemi micro-array). Per il momento, non viene previsto budget su questa voce di spesa.

Spese di brevettazione dei trovati. A carico dell’Associazione, previa Convenzione con l’Università di Ferrara.

Spese per l’identificazione di Industrie farmaceutiche interessate al trasferimento tecnologico e all’estensione dei brevetti a livello internazionale. A carico  dell’Associazione.

Missioni. Si prevede un intervento a co-finanziamento, da valutare caso per caso.

Ogni modifica a questo accordo di collaborazione dovrà essere  approvata da parte di tutti i soggetti coinvolti.



Il Responsabile della Ricerca, Prof. Roberto Gambari, Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare



Associazione Veneta per la lotta alla Talassemia,  c/o Centro di Microcitemia dell’Azienda ULSS 18, Rovigo

Il Presidente Dott. Elio Zago



Centro di Biotecnologie, Università di Ferrara (Direttore Prof. Roberto Gambari)



Ferrara, 18 luglio 2000