• La Talassemia

    La Talassemia è una grave anemia di origine genetica che si può manifestare quando due genitori sono entrambi microcitemici ossia portatori sani del difetto genetico. Per sopravvivere gli ammalati di talassemia devono sottoporsi in media ogni quindici-venti giorni a trasfusioni di sangue.

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  • A.V.L.T.

    L’Associazione rodigina ha cambiato il suo nome in “Associazione veneta per la lotta alla talassemia” nel 1983, quando, ormai, con le nuove terapie, moltissimi bambini talassemici erano diventati ragazzi e giovani. Infine, il 5 maggio 1996, l’Assemblea dell’Associazione ha approvato un nuovo Statuto e ha chiesto l’iscrizione al registro regionale veneto delle associazioni di volontariato.

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ACCORDO CON IL DR. STEFANO RIVELLA, DIRETTORE DEL LABORATORIO DI RICERCA SULLA TERAPIA GENICA DELLA TALASSEMIA, CORNELL UNIVERSITY DI NEW YORK (ottobre 2002)

Per poter essere ammessi a fare il ricercatore in una Università degli Stati Uniti, occorre che lo sponsor o gli sponsors del ricercatore si assumano l’impegno di pagargli lo stipendio di accesso fissato in misura uguale in tutte le Università.
Nel caso che ci riguarda, l’Associazione Veneta ha inviato al Dr. Rivella la lettera che segue, impegnandosi a pagare la differenza tra lo stipendio annuo di 32.000 dollari dovuto alla Dott.ssa Laura Breda e l’ammontare della borsa di studio 15.482 euro assegnata alla stessa ricercatrice dall’Università di Ferrara.

 

 

 

 

 

In seguito all’impegno assunto dall’Associazione Veneta, è stato possibile sottoscrivere l’Accordo che segue:

 

 

 

 

 

 

PROGETTO DI RICERCA

Riassunto

Il trapianto di midollo eterologo e’, attualmente, la sola cura definitiva per i malati di ß-talassemia. Sfortunatamente e’ una procedura molto rischiosa e l’identificazione di un donatore di midollo compatibile non e’ garantita. Queste limitazioni riducono drasticamente l’uso di questo approccio terapeutico. E’ necessario quindi trovare altre terapie per la cura della ß-talassemia. Un’alternativa si basa sull’introduzione permanente del gene della ß-globina umana corretto nelle cellule ematopoietiche staminali del paziente. Una seconda alternativa prevede l’identificazione e valutazione di nuove sostanze e/o farmaci che siano in grado di riattivare l’espressione dell’emoglobina fetale.

 

Lo scopo di questo progetto di ricerca e’ quello di sviluppare nuovi modelli murini (topi transgenici) per individuare gli approcci terapeutici ottimali. Una prima serie di modelli verra’ generato per valutare l’efficacia di vettori lentivirali che trasportano il gene della ß-globina umana. Allo stesso tempo verranno esplorate nuove tecniche di produzione in larga scale dei vettori lentivirali terapeutici per l’applicazione futura su modelli di primati non-umani e per la terapia della ß-talassemia.

 

Il secondo gruppo di modelli murini verra’ generato per identificare sostanze in grado di riattivare l’emoglobina fetale, come peptide nucleic acids (PNA), double stranded oligonucleotides (ODN) ed eventuali altri farmaci.

 

I punti principali del progetto sono

 

1) Sviluppo di modelli murini che esprimano l’emoglobina umana e siano affetti da ß-talassemia

2) Produzione e test di nuovi vettori lentivirali

3) Produzione e test di nuovi farmaci in grado di riattivare l’emoglobina fetale

Recensione della letteratura

La β-talassemia e’ una malattia genetica del sangue causata da una serie di mutazioni nel gene della β-globina umana che portano alla riduzione o mancanza di produzione dell’emoglobina adulta o emoglobina A. L’emoglobina A e’ composta da due catene proteiche chiamate alfa e da due chiamate beta (a2b2) e rappresenta l’emoglobina piu’ abbondante nelle persone adulte (95%). Il gene della beta-globina umana e’ responsabile della produzione delle catene beta dell’emoglobina A. Nei soggetti adulti sono presenti anche due emoglobine minori, chiamate, rispettivamente, emoglobina A2 (a2d2; 2-3.5% dell’emoglobina totale) ed emoglobina fetale (a2g2; <2% del totale). L’emoglobina fetale o F e’ l’emoglobina predominante nel feto e nelle prime settimane di vita. Dopo circa 48 settimane dalla nascita viene quasi completamente sostituita dall’emoglobina A. Pazienti in cui non si verifica il passaggio di produzione dall’ emoglobina fetale a quella adulta manifestano una condizione asintomatica chiamata “persistenza ereditaria di emoglobina fetale (HPFH)”. Ad esempio, mutazioni nella regione del promotore del gene che codifica per la catena g dell’emoglobina fetale sono responsabili di alcune forme della HPFH (1).

Alla luce di queste conoscenze sono due le strategie ideali per curare o alleviare i sintomi della ß-talassemia: la prima si basa sull’ inserimento stabile del gene terapeutico in cellule staminali ematopoietiche del paziente stesso e la seconda nella generazione di farmaci in grado di riattivare l’espressione dell’emoglobina fetale.

La β-talassemia e’ una malattia congenita ereditaria che colpisce le cellule ematopoietiche staminali e si manifesta in alcune delle cellule da loro derivate (cellule eritroidi). La terapia genica puo’ essere una potenziale soluzione per curare forme gravi di β-talassemia. Questo tipo di approccio offre la possibilita’ di inserire e fare esprimere il gene terapeutico nel tipo cellulare da modificare. La produzione della proteina verrebbe ottenuta in maniera prolungata o stabile se il gene venisse inserito nelle cellule staminali ematopoietiche. Un approccio ideale sarebbe l’inserimento del gene corretto attraverso la ricombinazione omologa per modificare la mutazione a carico del gene della β-globina. Tuttavia al momento, questa opzione non e’ praticabile. L’inserimento additivo del gene terapeutico e’, attualmente, la sola alternativa a condizione che si possa ottenere nelle cellule ematopietiche staminali l’introduzione del ß-globina in vivo.

I vettori lentivirali sono alcuni tra i vettori virali piu’ studiati (2). Questi vettori hanno l’abilita’ di infettare cellule che non si replicano o che si replicano a bassa efficienza, come le cellule staminali ematopoietiche. Inoltre, rispetto ai vettori oncoretrovirali, sono in grado di importare nelle cellule grandi frammenti di DNA senza riarrangiamenti, consentendo una migliore regolazione del gene terapeutico. Per questi motivi sono considerati, attualmente, il miglior sistema per infettare le cellule staminali ematopoietiche e ottenere alti livelli di espressione del gene terapeutico.

La regione genomica dove sono mappati i geni della famiglia della ß-globina di topo e’ costituita da due geni che producono due forme di emoglobina embrionale (ßh1 e ey2) e da due geni che producono due forme della ß-globina adulta, chiamati b1 (ßmajor) e b2 (ßminor). Quindi nel topo ci sono due geni che producono la ß-globina e nessun gene che produca l’emoglobina fetale. Nel topo si passa dalla produzione di emoglobina embrionale a quella di emoglobina adulta quando il feto e’ nelle ultime fasi di gestazione. E’ quindi opportuno generare un topo transgenico che contenga le regioni regolative e i geni della g e ß-globina umana se si vuole studiare l’effetto di sostanze che riattivano l’emoglobina fetale nel topo e il loro effetto in vivo.

Al momento attuale esistono solo tre modelli murini affetti da ß-talassemia. Questi modelli sono caratterizzati da mutazioni a carico dei geni della ß-globina, e sono definiti dalle lettere th (per thalassemia) e dai numeri 1,2 o 3. Il primo e il secondo modello (th1 e th2) sono caratterizzati da una delezione a carico del gene b1. I topi affetti da queste mutazioni che raggiungono la fase adulta sono affetti da una forma lieve di ß-talassemia (3,4). Il terzo modello (th3) e’ caratterizzato da una delezione sia del gene b1 che del gene b2 (4). In questo modello i topi omozigoti per questa delezione muoiono in utero, mentre gli eterozigoti (th3/+) sono vivi ma mostrano la forma piu’ severa di ß-talassemia fra i modelli murini, simile a quella intermedia negli uomini. Sfortunatamente non esiste un modello murino adulto di ß-talassemia maggiore e neanche un modello affetto da ß-talassemia che esprima emoglobina umana. Questo preclude, nel topo, la valutazione completa di vettori per la terapia genica della ß-talassemia umana.

Sommario delle scoperte precedenti.

Nel nostro laboratorio abbiamo creato e utilizzato un vettore lentivirale che trasporta il gene della ß-globina umana (TNS9) per inserire e modificare permanentemente cellule staminali e le cellule derivate da esse. Questo sistema permette, in maniera controllata, di inserire un numero limitato di copie del gene terapeutico per cellula. Inoltre abbiamo utilizzato ampi elementi regolatori essenziali per l’espressione del gene della ß-globina umana, come segmenti del Locus Control Region (LCR) o regioni enhancer. Questi elementi genetici ci hanno permesso di ottenere sia espressione tessuto specifica (solo in cellule eritroidi) che alti livelli di produzione del gene della ß-globina umana. Infatti esperimenti con questo vettore ci hanno permesso di ottenere i livelli di espressione piu’ alti mai pubblicati precedentemente in letteratura del gene della ß-globina umana con un sistema virale (6,7).

Analisi del livello di espressione di un vettore terapeutico che esprime il gene della ß-globina umana in vitro e in un modello murino affetto da ß-talassemia intermedia.

Per esaminare la regolazione e il livello di espressione del gene della ß-globina umana, abbiamo infettato sia colture cellulari eritroidi murine (MEL), sia cellule linfoidi (Jurkatt) che cellule mieloidi (HL60). Abbiamo cosi’ confermato che il vettore esprimeva la ß-globina solo in cellule eritroidi (MEL). La quantificazione del trascritto del gene della ß-globina e’ stata fatta attraverso la tecnica della Primer Extension, confrontando la quantita’ del trascritto (RNA) del gene della ß-globina umana con quella di topo. Come controllo abbiamo usato RNA estratto dal sangue periferico di un topo transgenico che esprime sia la ß-globina di topo che quella umana (6). Con questo sistema abbiamo osservato che TNS9 nelle cellule MEL e’ in grado di esprimere il 71,3±2.3% della ß-globina di topo.

Successivamente abbiamo dimostrato che TNS9 e’ in grado di curare l’anemia in topi affetti da ß-talassemia intermedia (5,7). Questi studi sono stati effettuati utilizzando topi eterozigoti per la mutazione th3 (th3/+), il modello murino che manifesta la forma piu’ severa di ß-talassemia fra i modelli murini e che e’ simile a quella intermedia negli esseri umani. Questi topi sono stati sottoposti a trapianti di midollo con cellule ematopoietiche staminali talassemiche (th3/+), infettate con TNS9. I livelli di emoglobina in questi topi, 15 settimane dopo il trapianto, erano saliti da 8-9 g/dl a 11-13 g/dl (p<0.04). Inoltre, ad un anno dal trapianto, i valori di emoglobina, di ematocrito e il numero di eritrociti erano ancora elevati. Durante lo stesso periodo non abbiamo osservato alcun declino nella proporzione di eritrociti (66-89%) che contenevano la ß-globina umana (17-22%). Infine la splenomegalia osservata nei topi affetti da ß-talassemia intermedia era scomparsa nei topi trattati con TNS9 (5,7).

In riassunto questi risultati ci hanno mostrato che possiamo curare una forma di ß-talassemia intermedia nel topo con TNS9 (migliorando e curando l’anemia, la splenomegalia e l’eritropoiesi incompleta). Inoltre, questi dati dimostrano che il livello di emoglobina del vettore TNS9 e’ in grado di alterare, in maniera positiva, il decorso della ß-talassemia intermedia (5,7).

Obiettivi

Allo scopo di valutare nuovi approcci terapeutici come la produzione di nuovi vettori lentivirali che esprimono la ß-globina umana e farmaci in grado di riattivare l’emoglobina fetale, e’ necessario produrre nuovi modelli murini che ci permettano di selezionare i sistemi terapeutici migliori.

E’ quindi essenziale generare modelli animali che riproducano il piu’ possibile la ß-talassemia e la produzione di emoglobina umane. Inoltre e’ necessario sviluppare il sistema piu’ efficace possibile per inserire il gene curativo.

1) Sviluppo di nuovi modelli murini che esprimano la emoglobina umana e che siano affetti da ß-talassemia per la valutazione di nuovi vettori terapeutici e di farmaci che riattivino l’emoglobina fetale

Il primo scopo del progetto e’ quello di sviluppare nuovi modelli animali che producano l’emoglobina umana sotto il controllo degli elementi regolatori di topo. La tecnologia per ottenere questo tipo di topi transgenici si chiama “plug and socket” (vedi testo in inglese per la descrizione del sistema). In riassunto si tratta di sostituire i geni che producono le globine di topo (alfa e beta) con le globine umane. Attualmente non esiste alcun modello murino che, esprimendo unicamente emoglobina umana, sopravviva con valori di emoglobina normale. Topi transgenici in cui sono stati introdotti i geni umani sotto il controllo delle sequenze regolative umane esprimono un livello di emoglobina sub-ottimale (6). Al contrario, con questi nuovi modelli si potrebbero produrre, inizialmente, quantita’ normali dei prodotti dei geni delle globine umane (alfa e beta) e, successivamente, forme della ß-globina che riproducono la ß-talassemia major. In questo caso i topi esprimerebbero esclusivamente forme umane adulte di emoglobine normali o patologiche. Successivamente, con questa tecnologia, si potrebbero introdurre anche altri geni utili a modificare l’eritropoiesi cosi’ come l’accumulo di ferro.

Per sviluppare un modello murino che permetta l’analisi in vivo di sostanze che riattivano l’espressione dell’emoglobina fetale, e’ necessario sviluppare dei modelli transgenici che esprimano la g e la ß-globina umane sotto il controllo degli elementi regolatori umani (promotori ed enhancers) nel locus della ß-globina di topo, a valle della LCR murina. La strategia che viene proposta e’ quella di sostituire i geni della ß-globina di topo con la regione genomica corrispondente a quella della g e della ß-globina umane. Questo e’ necessario perche’ le sostanze che verranno valutate saranno state selezionate per interagire direttamente con sequenze di DNA umano. Successivamente l’incrocio di topi affetti da forme di ß-talassemia con topi che hanno il potenziale di esprimere l’emoglobina fetale potra’ fornire un ottimo strumento per la valutazione terapeutica di questi farmaci. I topi verranno generati e mantenuti utilizzando i servizi della Cornell e del Memorial Sloan Kettering. Il livello di espressione dei geni verra’ monitorato utilizzando tecniche di PCR quantitativa, di Microarray e FACS analisi e tecniche standard di analisi di proteine.

In sommario, la prima parte del progetto si propone di sviluppare tre nuovi modelli murini: due che producano l’a e la ß-globina umana sotto il controllo di sequenze regolative di topo e uno che esprima la g e la ß-globina umane sotto il controllo degli elementi regolatori umani. La seconda fase del progetto verra’ caratterizzata dall’incrocio di questi topi per ottenere esclusivamente produzione di emoglobina umana. Nella parte finale del progetto i vari modelli murini verranno utilizzati per valutare l’efficacia delle terapie proposte (vettori terapeutici e farmaci).

2) Sviluppo di tecnologie di produzione in larga scala di vettori lentivirali terapeutici

Una delle applicazioni dello sviluppo dei modelli murini e’ la valutazione di vettori lentivirali che producano la ß-globina umana. Il livello di espressione di questi vettori verra’ valutato nel midolo, nella milza e nel sangue periferico di questi nuovi modelli di topo infettati con i vettori terapeutici. Il primo vantaggio di questi modelli sara’ quello di verificare il potenziale terapeutico di questi vettori in un sistema che esprime esclusivamente emoglobina umana. Il secondo beneficio consiste nel prevenire la formazione di emoglobine chimeriche (alfa di topo e beta umana), di cui non si conoscono le proprieta’ biochimiche. Questo dovrebbe facilitare l’identificazione del miglior vettore terapeutico. Verra’ quindi analizzato il livello di chimerismo (percentuale di midollo ripopolato con cellule corrette dal vettore), il miglioramento del livello di anemia, dell’eritropoiesi e dei valori fisio-patologici.

Inoltre e’ necessario sviluppare nuove tecnologie che permettano di produrre grandi quantita’ del vettore terapeutico. Attualmente la produzione del vettore terapeutico e’ un processo lungo e tedioso. Inoltre richiede preparazioni di grandi quantita’ di DNA plasmidico e costante espansione di colture cellulari (cellule 293T). Il DNA plasmidico produce le proteine virali e il vettore terapeutico una volta introdotto nelle cellule 293T. Alcuni giorni dopo l’introduzione (trasfezione) del DNA plasmidico nelle cellule 293T, il virus terapeutico viene prodotto nel terreno di coltura delle cellule e recuperato. Il virus viene quindi ultracentrifugato per aumentare la sua concentrazione o titolo virale (numero di particelle virali per mL). Questo processo aumenta il numero di cellule che possono essere infettate. Il titolo virale viene valutato dopo infezione di colture cellulari standard con un’ aliquota della produzione del vettore terapeutico. Tutti questi passaggi devono essere ripetuti ogni volta che il virus deve essere preparato. Tre litri di virus vengono generalmente concentrati in un volume finale di 1 mL, generalmente sufficienti per infettare solo 0.5-1 milioni di cellule staminali ematopoietiche. E’ quindi necessario che una sola persona si dedichi, a tempo pieno, alla produzione di vettori lentivirali e allo sviluppo di nuove tecniche che possano accelerare la produzione dei vettori terapeutici.

Bibliografia

1) Li Q, Duan ZJ, Stamatoyannopoulos G. “Analysis of the mechanism of action of non-deletion hereditary persistence of fetal hemoglobin mutants in transgenic mice.”EMBO J. 2001 Jan 15;20(1-2):157-64.
2) Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D. “In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector”. Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7.
3) Skow LC, Burkhart BA, Johnson FM, Popp RA, Popp DM, Goldberg SZ, Anderson WF, Barnett LB, Lewis SE. “A mouse model for beta-thalassemia.” Cell. 1983 Oct;34(3):1043-52.
4) Ciavatta DJ, Ryan TM, Farmer SC, Townes TM. “Mouse model of human beta zero thalassemia: targeted deletion of the mouse beta maj- and beta min-globin genes in embryonic stem cells.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Sep 26;92(20):9259-63.
5) May C., Rivella S., Callegari J., Heller G., Gaensler KM., Luzzatto L., Sadelain M. "Therapeutic haemoglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expressing lentivirus-encoded human beta-globin". Nature; 406(6791): 82-6, (2000)
6) Orcu S, Kitamura M, Witkowska E, Zhang Z, Mutero A, Lin C, Chang J, Gaensler KM. “The human beta globin locus introduced by YAC transfer exhibits a specific and reproducible pattern of developmental regulation in transgenic mice”. Blood. 1997 Dec 1;90(11):4602-9.
7) May C., Rivella S., Chadburn A., Sadelain M. “Successful treatment of b-thalassemia intermedia by transfer of the human -globin gene”. Blood, 15 March 2002, vol.99, number 6.

 

 

 

 

 

 

 

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