• La Talassemia

    La Talassemia è una grave anemia di origine genetica che si può manifestare quando due genitori sono entrambi microcitemici ossia portatori sani del difetto genetico. Per sopravvivere gli ammalati di talassemia devono sottoporsi in media ogni quindici-venti giorni a trasfusioni di sangue.

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  • A.V.L.T.

    L’Associazione rodigina ha cambiato il suo nome in “Associazione veneta per la lotta alla talassemia” nel 1983, quando, ormai, con le nuove terapie, moltissimi bambini talassemici erano diventati ragazzi e giovani. Infine, il 5 maggio 1996, l’Assemblea dell’Associazione ha approvato un nuovo Statuto e ha chiesto l’iscrizione al registro regionale veneto delle associazioni di volontariato.

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RELAZIONE DEL PROF. ROBERTO GAMBARI SULL'ATTIVITA' DEL THALLAB (anni 2000-2001)

RELAZIONE SULL’ATTIVITA’ DEL LABORATORIO DI RICERCA

SULLA TERAPIA FARMACOLOGICA E GENICA DELLA TALASSEMIA

(Laboratory for the Development of Pharmacological and Gene Therapy of Thalassaemia)

Responsabile scientifico: Prof. Roberto Gambari

Anno 2000-2001

Premessa

Il LABORATORIO DI RICERCA SULLA TERAPIA FARMACOLOGICA E GENICA DELLA TALASSEMIA (Laboratory for the Development of Pharmacological and Gene Therapy of Thalassaemia, ThalLab) è stato costituito in seguito ad un Accordo di collaborazione tra il Centro di Biotecnologie dell’Università di Ferrara (CBF) e l’Associazione Veneta per la lotta alla Talassemia, di Rovigo. Il Laboratorio è diretto da un Responsabile, coadiuvato da un Consiglio formato dallo stesso responsabile, dai ricercatori coinvolti, dai rappresentanti dell’Associazione, e dai rappresentanti dei partners e/o maggiori finanziatori delle attività di ricerca. Il Consiglio programma e valuta l’attività riunendosi almeno due volte all’anno. Il Responsabile presenta ai membri del Consiglio il programma annuale di attività, inviando ogni anno una relazione scritta sull’attività svolta.

 

La sede del Laboratorio è presso il Centro di Biotecnologie dell’Università di Ferrara (CBF). Presso tale centro sono disponibili numerose apparecchiature di particolare rilevanza, tra le quali citiamo un Sequenziatore di DNA ALF DNA Sequencing System (Pharmacia), un Sequenziatore di DNA ABI PRISM 377 DNA SEQUENCER (Perkin-Elmer), un Citofluorimetro Becton-Dickinson a flusso FacStar plus accessoriato (FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter), N.2 Laboratori a contenimento biologico di classe P3, un BIAcore-1000 System (Pharmacia Biosensors), HPLC preparative (Millipore), un Sintetizzatore di peptidi automatico Milligen (Millipore), un Sistema integrato di estrazione e quantificazione del DNA (Kontron instruments), un Contatore Beta mod. 2100 TR (Camberra Packard).

 

 

Obiettivo generale

 

Lo scopo dell’attività di ricerca del ThalLab è identificare e caratterizzare l’attività di biomolecole in grado di promuovere la trascrizione dei geni globinici, con particolare riferimento ai geni codificanti per la globina g e la globina e. Questa ricerca è indispensabile premessa al trattamento farmacologico di pazienti affetti da beta-talassemia e anemia falciforme mirante alla produzione da parte degli stessi di emoglobina fetale HbF. Questo permetterebbe di rendere il paziente indipendente dal trattamento trasfusionale.

 

 

Principali Obiettivi specifici

Gli obiettivi del Laboratorio di Ricerca per lo Sviluppo della Terapia Farmacologica e Genica della Talassemia, all’atto della sua consituzione, erano i seguenti:

1. Coordinare le ricerche volte alla identificazione di nuovi induttori del differenziamento eritroide in cellule K562.

2. Acquisire nuove tecniche di isolamento, clonazione e differenziamento in vitro di cellule ematopoietiche. Un primo obiettivo era quello di trasferire presso l’Università degli Studi di Ferrara il metodo sviluppato da Eitan Fibach (Blood, 73, 100-103, 1989) sulle colture eritroidi da sangue periferico. Questo metodo era fondamentale per la valorizzazione delle ricerche effettuate sulle cellule K562 e avrebbe permesso di valorizzare anche scoperte oggetto di brevetto riguardanti potenziali induttori dell’espressione dei geni g-globinici.

3. Mettere a punto RT-PCR quantitativa per l’identificazione dei trascritti g-globinici.

4. Produrre brevetti su molecole in grado di indurre il differenziamento eritroide. Si prevedeva di essere in grado di produrre 3 brevetti nel triennio 2000-2002.

5. Eseguire le ricerche finalizzate alla valorizzazione dei brevetti su oligonucleotidi sintetici in grado di indurre il differenziamento eritroide.

6. Pubblicare su riviste di elevato prestigio internazionale le ricerche sulla Talassemia. Il nome dell’Associazione dovrà essere riportato sulle eventuali pubblicazioni scientifiche.

7. Organizzare seminari di informazione sull’attività di ricerca internazionale riguardante le emoglobinopatie e temi affini.

8. Coordinare anche interventi di tipo divulgativo sulle basi molecolari e sulla terapia della b-talassemia, finalizzati a diffondere le ricerche presso studenti universitari e scuole secondarie.

 

 

Risultati ottenuti e prodotti

Coordinamento di ricerche volte alla identificazione di nuovi induttori del differenziamento eritroide in cellule K562.

Abbiamo analizzato un numero rilevante di biomolecole potenzialmente in grado di indurre il differenziamento eritroide. Il numero complessivo di biomolecole analizzate è stato superiore a 100. Di queste, abbiamo identificato almeno quindici nuovi induttori del differenziamento delle cellule K562, da proporre per una sperimentazione su cellule eritroidi isolate da soggetti normali e pazienti affetti da talassemia di tipo beta.

Produzione di brevetti su molecole in grado di indurre il differenziamento eritroide.

Brevetto n. TO2001A000922, 27-09-2001: "Derivati 3-Deossi-3-ammidici e 3-Deossi-3-chetonici di carboidrati come induttori del differenziamento cellulare eritroide". Inventori: Catelani Giorgio, D'Andrea Felicia, Gambari Roberto, Spitaleri Andrea.

Brevetto PCT/EP01/02804, 13 marzo 2001: "Synthetic oligonucleotides as inducers of erythroid differentiation", Inventors: Bianchi Nicoletta, Gambari Roberto, Feriotto Giordana, Mischiati Carlo.

Brevetto n. T02001A000633, 2 luglio 2001: "Nuovo impiego di poliammidi eterocicliche e benzoeterocicliche strutturalmente correlate all'antibiotico naturale distamicina A". Inventori: Baraldi Per Giovanni, Bianchi Nicoletta, Feriotto Giordana, Gambari Roberto, Mischiati Carlo, Romagnoli Romeo.

Acquisizione di nuove tecniche di isolamento, clonazione e differenziamento in vitro di cellule ematopoietiche.

Il primo obiettivo è stato quello di trasferire presso l’Università degli Studi di Ferrara il metodo sviluppato da Eitan Fibach (Blood, 73, 100-103, 1989) sulle colture eritroidi da sangue periferico. Questa attività è stata condotta a termine attraverso una fase scientifica che ha comportato l’attivazione di un Progetto bilaterale Italia-Israele (CNR-MOS) e una fase organizzativa, che ha tratto grande giovamento dalla disponibilità dell’Ospedale di Rovigo di procurare campioni di buffy-coat provenienti da donazioni di sangue e contenenti le cellule che a noi interessavano. La fase scientifica ha comportato la venuta presso il ThalLab del Prof. Fibach e della Dott.ssa Prous (Hematology Department, Hadassah Hospital, Israel), che hanno condotto un teaching altamente qualificato. Il ThalLab è attualmente indipendente in questa sperimentazione e, di norma, viene settimanalmente messo in coltura materiale proveniente da due soggetti. Il ThalLab perciò può essere considerato come un punto di riferimento per lo screening di composti in grado di indurre produzione di HbF. Un esempio a sostegno di quanto affermato è un Progetto di collaborazione con l’industria Chiesi sullo screening di circa 150 molecole prodotte dalla stessa.

Messa a punto RT-PCR quantitativa per l’identificazione dei trascritti g-globinici.

Questa tecnologia è stata messa a punto definitivamente. Siamo in grado di quantificare l’espressione dei geni codificanti le globine umane beta, gamma e alfa; il protocollo prevede la quantificazione rispetto a mRNA di controllo, quali quelli codificanti per GAPDH e actina.

Esecuzione di ricerche finalizzate alla valorizzazione dei brevetti su oligonucleotidi sintetici in grado di indurre il differenziamento eritroide.

Queste ricerche hanno permesso di ottenere risultati che suggeriscono un possibile utilizzo di oligonucleotidi per l’induzione di HbF. Abbiamo eseguito esperimenti che suggeriscono che uno degli oligonucleotidi di riferimento è in grado di portare in cellule eritroidi l’HbF dal 1.8-2.5% al 6-7%. Questo incremento, se confermato, è significativo e supera l’attività dell’idrossiurea, attualmente utilizzata in trials clinici su pazienti omozigoti. Questa parte del Progetto ha un interesse industriale, dimostrato dal fatto che Chiesi ha recentemente acquisito il 33% del brevetto, con una opzione per l’acquisto completo entro tre anni. Il brevetto è stato reso PCT (internazionale).

Identificazione di una molecola presente in estratti di Aegle Marmelos e in grado di indurre il differenziamento eritroide.

Abbiamo identificato una molecola presente in estratti della pianta medicinale Eagle Marmelos e in grado di indurer il differenziamento eritroide in cellule K562 senza alterare in modo significativo la proliferazione cellulare.

Coordinamento di interventi di tipo divulgativo sulle basi molecolari e sulla terapia della b-talassemia finalizzati a diffondere le ricerche presso studenti universitari e scuole secondarie.

Il Prof. Gambari è stato il responsabile scientifico della produzione di un CD-Rom mutimediale dal titolo "The Thal World" (Pianeta Talassemia: allegato 1) che sarà distribuito alle famiglie e agli studenti della scuola media.

 

 

Sviluppi futuri

 

Oltre alle iniziative già descritte nelle sezioni precedenti, il ThalLab ha in programma per i prossimi anni:

 

L'analisi utilizzando tecnologie di avanguardia (microarray) dell'espressione genica in soggetti con HPFH;

 

Messa a punto di microchip e di protocolli utilizzando biosensori per analizzare le mutazioni in pazienti talassemici;

 

Analizzare biomolecole basate su DNA e PNA quali potenziali induttori di HbF;

 

Collaborare per lo studio di biomolecole in grado di indurre HbF in sistemi "in vivo" (topi transgenici).

 

 


ALLEGATO 1

The Thal World

(Pianeta Talassemia: basi molecolari, diagnostica e prospettive terapeutiche)

 

A. Informazioni generali

(Il sangue, l'emoglobina, la talassemia: prime informazioni generali)

A1. Definizione (I)

A2. Il sangue (I)(Figure: 2)

A2a. I globuli bianchi

A2b. I globuli rossi

A2c. Le piastrine

A3. I geni (I geni per le globine) (I)

A4. L'emoglobine (L'emoglobina: struttura e funzioni) (I)

(Figure: 1)

A5. Emoglobine e geni (Emoglobine e geni per le globine) (II)

A5a. Emoglobine (Le emoglobine nell'uomo) (Figure: 2)

A5b. I geni (Struttura ed organizzazione dei geni per le

globine nel genoma umano) (Figure: 2)

A5c. Espressione genica (Espressione dei geni per le globine durante l'ontogenesi)

(Figure: 1)

 

B. Distribuzione (Distribuzione della malattia)

B1. Distribuzione

(Incidenza della talassemia in Italia e nel mondo) (I) (Figure: 2)

B2. Talassemia e malaria (L'origine della talassemia: talassemia e malaria) (I)

 

C. Fisopatologia (Fisiopatologia e manifestazioni cliniche)

C1. Ereditarietà (La trasmissione ereditaria della talassemia) (I)

(Figure: 4)

C2. Fisiopatologia (Manifestazioni fisio-patologiche della talassemia (I)

(Figure: 2)

C2a. Talassemia beta major

C2b. Talassemia beta minor

C2c. Talassemia alfa

C2d. Altre emoglobinopatie

(Altre emoglobinopatie: la drepanocitosi)

 

D. Basi molecolari

(Basi molecolari della talassemia: una introduzione alla genetica molecolare (II)

D1. Delezioni

(Delezioni di segmenti genomici) (Figure: 1)

D2. Mutazioni e trascrizione

(Mutazioni che modificano la trascrizione dei geni

globinici) (Figure: 1)

D3. Mutazioni e splicing

(Mutazioni che modificano la corretta maturazione

dell'mRNA)

D4. Mutazioni e traduzione

(Mutazioni che alterano la traduzione dell'mRNA)

D5. Mutazioni di senso

(Mutazioni che alterano la sequenza aminoacidica della

beta-globina: l'anemia falciforme)

 

E. Diagnosi e prevenzione

E1. Prevenzione

(Come prevenire la talassemia) (I)

E2. Diagnosi

(Diagnosi della talassemia nell'adulto, nel feto, nell'embrione) (I)

E3. Diagnosi

(Diagnosi della talassemia nell'adulto, nel feto, nell'embrione) (II) (Figure: 12)

E3a. Laboratorio I livello

(Le indagini di laboratorio di primo livello)

E3a1. Esame emocromocitometrico

E3a2. Dosaggio delle frazioni emoglobiniche

E3a3. Stato marziale (Stato marziale: indagine di prima o seconda istanza?)

E3a4. Variabilità analitica

(Variabilità analitica e limiti di confidenza dei risultati quantitativi dei test di primo livello)

E3a5. Referto

(Formato del referto per esami di primo livello).

 

E3b. Laboratorio II livello: analisi del sangue fetale

(Le indagini di laboratorio di secondo livello: diagnosi

prenatale di talassemia nel feto tramite analisi del

sangue fetale e sintesi in vitro delle globine)

E3b1. Prelievo (Tecniche ostetriche di prelievo

del sangue fetale)

E3b2. Contaminazione (Come suprare il problema della contaminazione dei campione con emazie della madre)

E3b3. Analisi (Analisi del campione per determinare le percentuali di emoglobine o di

globine di neosintesi)

E3b3a. Immunofluorescenza

E3b3b. Isoelettrofocalizzazione

E3b3c. Biosinetsi in vitro

E3c. Laboratorio II livello: analisi del DNA

(Le indagini di laboratorio di secondo livello: Diagnosi

prenatale di talassemia nel feto o nell'embrione, mediante analisi del DNA)

E3c1. Southern blotting

E3c1a. Analisi dei geni per le globine

E3c1b. RFLP

 

E3c2. PCR

E3c3. PCR e Sequenziamento

 

E3d. Laboratorio II livello: vantaggi e rischi

(Analisi comparata dei vantaggi e dei rischi delle diverse metodiche di diagnosi prenatale di talassemia)

 

E3e. Laboratorio II livello: diagnosi di a-talassemia

(Diagnosi di a-talassemia nell'adulto, nel neonato e nel feto)

E4. Diagnostica avanzata (II) (Figure: 5)

E4a. I biosensori in diagnostica

 

 

F. Terapia

F1. Trattamento (Il trattamento della talassemia)

F1a. Terapia trasfusionale (I)

F1b. Trapianto di midollo (I)

F2. Prospettive di terapia: la terapia genica (I) (Figure: 1)

F3. Prospettive di terapia: la terapia genica (II) (Figure: 4)

F4. Prospettive di terapia: induzione di HbF nell'adulto (I) (Figure: 1)

F5. Prospettive di terapia: induzione di HbF nell'adulto (II) (Figure: 2)

F5a. Il fenotipo HPFH (II)

F5b. Modelli sperimentali (II)

F5c. Colture di cellule staminali umane (II)

 

 

G. Internet (Talassemia e INTERNET)

 

 

 

 

H. Iniziative (Le iniziative sulla talassemia nella province di Ferrara e Rovigo)

I. Gli autori

J. Strutture

K. Bibliografia (Riferimenti bibliografici: per un approfondimento)

L. Glossario

 

 

 

 

 

Livello base: informazioni per famiglie e studenti della Scuola Media Inferiore

Livello avanzato: informazioni per studenti della Scuola Media Superiore e per studenti universitari

 

 

 

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